蟲草素對小鼠慢性哮喘模型支氣管平滑肌收縮的作用及機(jī)制研究

張旻¹  周新¹  唐亮²  余伯成²  李鋒¹  張杏怡¹

（1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸科，上海200080；

2. 上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，上海200001）

【摘要】 目的 評價蟲草素及蟲草素與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用對慢性哮喘模型小鼠氣道平滑肌收縮的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。方法 將32只C57／BI6小鼠隨機(jī)分成對照組和慢性哮喘模型組，利用肌動描記儀比較p38蛋白激酶抑制劑SB239063(10^-6 M)、蟲草素(10^-6M)以及糖皮質(zhì)激素地塞米松(10^-6 M)單獨(dú)或聯(lián)合孵育前、后由乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)誘導(dǎo)的支氣管收縮反應(yīng)，同時應(yīng)用蛋白印跡檢測支氣管組織中p38蛋白激酶和熱休克蛋白              27(heat shock proteins 27，HSP27)的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果 模型組小鼠的支氣管收縮較對照組加重，有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組和模型組p38蛋白激酶抑制劑SB239063孵育1 h后對Ach介導(dǎo)的收縮反應(yīng)較空白對照組下降(P<0.05)，地塞米松單獨(dú)和地塞米松聯(lián)合蟲草素在模型組小鼠Ach誘導(dǎo)支氣管平滑肌收縮力的作用均較對照組降低(P<0.05)；地塞米松單獨(dú)和地塞米松聯(lián)合蟲草素孵育后，對照組和模型組小鼠支氣管組織p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平較Ach單純作用組降低，而且在模型組，使用蟲草素干預(yù)后p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平較Ach單純作用組下降(P值均<0.05)。結(jié)論　Ach誘導(dǎo)的離體支氣管收縮反應(yīng)具有良好的可重復(fù)性，卵清白蛋白吸入可導(dǎo)致Ach誘導(dǎo)的支氣管收縮反應(yīng)加重。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合蟲草素治療較糖皮質(zhì)激素單獨(dú)治療更有效抑制Ach誘導(dǎo)的氣道平滑肌收縮，此種潛在的協(xié)同作用可能通過更大程度地抑制p38蛋白激酶信號通路為機(jī)制。

      支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見呼吸系統(tǒng)慢性疾病，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)持續(xù)上升，未來15～20年內(nèi)，全球哮喘患者將由目前的3億升至4億，并由此引發(fā)嚴(yán)重的疾病相關(guān)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)是指氣道的過度收縮，表現(xiàn)為氣道對一系列藥理、化學(xué)、生理性吸入刺激物(包括膽堿類、組胺、腺苷單磷酸、二氧化硫、冷空氣等)產(chǎn)生的過渡收縮反應(yīng)。作為哮喘進(jìn)展的危險因素，AHR與疾病的嚴(yán)重程度、肺功能降低程度相關(guān)，為評價藥物療效的重要終點(diǎn)指標(biāo)之一。故深入研究氣道平滑肌的收縮機(jī)制對于認(rèn)識、防治氣道平滑肌過度收縮即AHR有著重要意義。

      絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)屬于絲／蘇氨酸激酶家族，包括三個主要的蛋白激酶途徑，有研究表明其在乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)中受到活化。并啟動其下游信號鏈參與氣道平滑肌的收縮。

      糖皮質(zhì)激素(簡稱激素)是治療哮喘有效的抗炎和預(yù)防藥物，目前有關(guān)激素作用機(jī)制的研究多注重于抗炎作用，而抑制氣道平滑肌收縮效應(yīng)的研究報道較少。蟲草素(3’-脫氧腺苷)是冬蟲夏草的主要藥理成分，我們既往研究表明其對于慢性哮喘的炎癥和氣道重塑有一定作用，而對于氣道平滑肌的直接作用了解很少。本研究旨在應(yīng)用肌動掃描技術(shù)檢測不同濃度蟲草素、激素以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對離體支氣管收縮力的作用，以觀察蟲草素與激素對氣道平滑肌收縮力的直接作用以及有無協(xié)同作用，并通過對Ach誘導(dǎo)離體支氣管收縮后觀察激素和(或)蟲草素對于p38MAPK磷酸化水平的作用，探究上述信號通路在Ach誘導(dǎo)的平滑肌收縮的作用以及對于激素和(或)蟲草素治療的介導(dǎo)作用。

      AHR是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要危險因素之一，與疾病的嚴(yán)重程度、肺功能降低程度相關(guān)。過去AHR僅被視為氣道炎癥的表象，故對其研究只關(guān)注于炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和免疫應(yīng)答，而作為氣道收縮的效應(yīng)器—?dú)獾榔交￡P(guān)注較少。近年研究發(fā)現(xiàn)，氣道炎癥和AHR存在分離現(xiàn)象，即兩者并不一定并行存在，因此推測AHR可能獨(dú)立氣道炎癥或氣道炎癥發(fā)生之前即可存在。

      氣道平滑肌收縮的兩個基本特征是產(chǎn)生收縮力的能力和氣道收縮的速率，而后者取決于平滑肌收縮時所遇到的阻力負(fù)荷。因此，我們在進(jìn)行肌動描記操作之前，首先以高鉀溶液獲得氣管平滑肌最大長度，在最大長度的基礎(chǔ)上檢測平滑肌收縮反應(yīng)即收縮張力。氣道平滑肌收縮的另一個特點(diǎn)是它可因激動劑濃度梯度的增加而逐漸產(chǎn)生興奮、收縮，直到一個頂點(diǎn)即所有的受體均被該激動劑結(jié)合。這樣就產(chǎn)生一個劑量(Log對數(shù))一反應(yīng)的S形曲線，這個曲線的特征包括位置(靈敏性)、斜率(反應(yīng)性)、平臺(最大反應(yīng)值)。

      本實驗采用肌動描記技術(shù)和Ach梯度滴定，檢測離體支氣管的收縮反應(yīng)、收縮張力。首先，我們檢測支氣管的收縮反應(yīng)是否具有可重復(fù)性，我們的結(jié)果與Liu等的報道類似，即Ach誘導(dǎo)的離體支氣管收縮反應(yīng)具有很好的可重復(fù)性，從而便于我們進(jìn)行后續(xù)的實驗研究，其次通過對空氣組和OVA暴露組小鼠在Ach誘導(dǎo)支氣管收縮反應(yīng)比較發(fā)現(xiàn)，OVA暴露小鼠可加重平滑肌收縮反應(yīng)。

      p38MAPK受到環(huán)境應(yīng)激、細(xì)胞因子(TNF-a、IL-1β)、內(nèi)毒素、香煙煙霧、生長因子和共刺激分子等作用時，既可活化TNF-a，參與細(xì)胞分化、生長、凋亡、移行。p38MAPK抑制劑SB203580(而非ERK抑制劑PD98059)可抑制平滑肌收縮。Kwon和Lee等的研究證實，p38MAPK／HSP27(而非ERK)參與ET-1介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠的主動脈收縮。最近，Ihara等的研究總結(jié)了p38MAPK途徑通過數(shù)種方式調(diào)節(jié)胃腸平滑肌收縮：①p38MAPK／HSP27可逆轉(zhuǎn)鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白對肌球蛋白Ⅱ的Mg-ATP酶抑制效應(yīng)；②p38MAPK通過磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1而抑制MLCP活性，引發(fā)肌肉收縮。由于我們前期對于大鼠的研究提示蟲草素可能更多地依賴抑制MAPK家族的成員之一的p38MAPK信號通路中起效，因此本次對于小鼠氣道收縮的研究聚焦p38MAPK在蟲草素和(或)糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的氣道收縮中的作用。我們的研究結(jié)果顯示分離的小鼠支管對Ach的最大等長收縮力受到p38MAPK抑制劑的抑制，表明p38MAPK參與支氣管平滑肌最大等長收縮反應(yīng)。

      激素是在慢性哮喘中最常應(yīng)用也是迄今為止最為有效的抗炎藥物，其通過與相關(guān)基因啟動子或增強(qiáng)子的激素反應(yīng)元件相互作用，經(jīng)轉(zhuǎn)錄活化誘導(dǎo)抗炎基因的表達(dá)，或直接與轉(zhuǎn)錄因子如NF-кB、APLl等結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制而下調(diào)炎性基因的表達(dá)。激素對激動劑引起的平滑肌收縮具有抑制效應(yīng)。Sun等報道，布地奈德可在15 min內(nèi)減少豚鼠的氣道平滑肌等長張力收縮。目前有關(guān)激素作用機(jī)制的研究多聚焦于抗炎作用，而其抑制氣道平滑肌收縮效應(yīng)的研究報道較少。研究激素與氣道平滑肌的直接作用，有助于理解激素的作用機(jī)制。在本實驗中，激素孵育1 h即可抑制氣道平滑肌收縮力。因此我們推測，激素也有可能通過非基因組機(jī)制發(fā)揮作用。

       Linden研究發(fā)現(xiàn)胞外腺苷聚集是炎癥反應(yīng)初始階段限制細(xì)胞損傷的機(jī)體防御性反應(yīng)，是保護(hù)性的自分泌和旁分泌的信號傳導(dǎo)機(jī)制。腺苷和其他內(nèi)源性物質(zhì)在炎癥反應(yīng)中適度激活抑制性信號傳導(dǎo)系統(tǒng)．其重要性在多種炎癥疾病中都已被證明(如敗血癥、類風(fēng)濕一睢關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和腫瘤等)。體外實驗證明腺苷能抑制中性粒細(xì)胞功能(如抑制其產(chǎn)生氧自由基、黏附血管內(nèi)皮、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬作用等)，亦能抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，還能下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的活化(包括抑制細(xì)胞因子的釋放和黏附分子的表達(dá))。腺苷在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用足通過AR介導(dǎo)，在前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲草素可能基于激活A2aAR而發(fā)揮潛在的抗炎作用，但在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用蟲草素對于氣道平滑肌收縮力產(chǎn)生一定的收縮抑制作用，但僅在OVA組產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)意義，是否由于在OVA刺激下激活一定量A2aAR受體后方參與氣道平滑肌收縮力的抑制作用則需進(jìn)一步研究，然而Dex聯(lián)合蟲草素治療則仍表現(xiàn)出一定的抑制氣道平滑肌收縮作用，而且效果似乎優(yōu)于Dex單獨(dú)干預(yù)組，而對于p38MAPK/HSP27信號通路的抑制作用較激素單獨(dú)應(yīng)用組有增大趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，因此兩者的協(xié)同作用有待于進(jìn)一步研究。同時我們發(fā)現(xiàn)在哮喘模型的小鼠支氣管，與對照組相比較不論蟲草素單獨(dú)及和激素聯(lián)合應(yīng)用都具有更強(qiáng)的抑制p38MAPK/HSP27磷酸化的作用，提示蟲草素可能對活化而非生理性的p38MAPK信號通路產(chǎn)生作用。 

       總之，我們的研究表明Ach誘導(dǎo)的離體支氣管收縮反應(yīng)具有良好的可重復(fù)性，OVA吸人可 導(dǎo)致Ach誘導(dǎo)的支氣管收縮作用加重。p38MAPK信號通路參與Ach誘導(dǎo)的氣道平滑肌收縮反應(yīng)，激素可有效抑制Ach誘導(dǎo)的氣道平滑肌收縮，而聯(lián)合蟲草素治療可使上述平滑肌收縮抑制能力進(jìn)一步加強(qiáng)，激素聯(lián)合蟲草治療可能通過抑制p38MAPK/HSP27磷酸化水平發(fā)揮上述作用。

（摘自：《國際呼吸雜志》2012年第32卷第20期：1545-1551）