蟲草素對結腸癌細胞體外增殖、遷移能力的影響及其誘導細胞凋亡的作用

蔡 偉¹ 葉 青¹　唐 亮²　余伯成²　鄭民華¹

(1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025；

2. 上海國寶企業發展中心，上海200001）

【摘要】 目的 研究蟲草素在體外對結腸癌細胞增殖、遷移能力的影響，及其誘導腫瘤細胞凋亡的作用。方法　按血清藥理學實驗原則，將20只BALB/c裸鼠隨機分為兩組，分別喂飼蟲草素或生理鹽水，3d后處死取血清，將血清按下列不同處理方法在體外與人結腸癌細胞株SW1116共培養：(1)蟲草素組；(2)化療組；(3)蟲草素＋化療組（下稱：聯合用藥組）；(4)空白對照組（下稱：對照組）。以CCK-8法檢測細胞增殖抑制作用，Transwell小室觀察檢測細胞遷移能力，熒光染色和流式細胞檢測法觀察細胞凋亡情況。結果  (1) SW1116細胞經蟲草素＋順鉑聯合作用96h、120h后，細胞增殖的抑制率顯著高于其余三組（P＝0.02）；(2)蟲草素聯合順鉑能顯著減少腫瘤細胞遷移數（P<0.05）；(3)經Hoechst33258熒光染色，在聯合用藥組中見大量被染成亮藍色的凋亡細胞，流式細胞儀定量分析顯示該組細胞凋亡率明顯高于其余三組（P<0.05）。結論 蟲草素及鉑類化療藥（順鉑）對人結腸癌細胞株SW1116有顯著抑增殖、抗遷移和促凋亡作用，蟲草素與順鉑合用可顯著提高這一療效，提示蟲草素有一定的化療輔助作用。

蟲草素（Cordycepin）是北冬蟲夏草中最主要的生理活性成分。傳統醫學認為：冬蟲夏草性平味甘，入肺、腎二經，“肺與大腸相表里”。研究顯示北冬蟲夏草具有提高免疫力和抗腫瘤的作用。但是冬蟲夏草的主要有效成分蟲草素是否同樣具有預防和治療結腸癌的作用及其作用機制引起廣泛關注。本研究運用血清藥理學的方法，給BALB/C裸鼠分別喂飼蟲草素或同體積生理鹽水后處死取血清，將各組血清分別或聯合順鉑在體外與人結腸癌細胞株SW1116共培養，研究蟲草素對結腸癌細胞的增殖、遷移能力的影響，及其誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

一、用“血清藥理學方法”研究蟲草素抗結腸癌細胞的意義

近年來，結腸惡性腫瘤的發病率與死亡率呈上升趨勢，歐美國家結直腸癌的發病率位列惡性腫瘤的第二位，在我國為第四位。據2005年上海統計，結直腸癌的發病率已高居惡性腫瘤的第二位。

       手術仍是目前治療結直腸腫瘤的主要手段。但近30年來療效提高并不顯著。由于大部分結直腸惡性腫瘤患者在臨床確診時已伴有腹膜轉移或其他重要臟器的微轉移，單靠擴大切除范圍難以改善預后。臨床常采用術后輔助化療為主的綜合治療方案，間或加用物理治療、靶向藥物和中藥，但中晚期患者的術后無瘤生存率和總生存率仍不令人滿意。約有50％的患者死于術后腫瘤的復發和轉移。因此，有必要探尋新型輔助藥物以提高結直腸癌療效，改善預后。

       冬蟲夏草是我國的珍稀藥材，其具有提高免疫力和抗腫瘤的作用。現代醫學研究顯示：冬蟲夏草中最主要的生理活性成分為蟲草素和蟲草多糖（CP）。有研究顯示CP可以通過激活宿主免疫反應而發揮抗腫瘤作用。另有研究顯示蟲草素和CP能夠促進人扁桃體及小鼠T-淋巴細胞的增殖，并且能夠促進環磷酰胺（CY）抑制鼠脾活化T細胞增殖；在一定濃度下，可以顯著升高人扁桃體活化T細胞TNF-β的分泌水平，這對增強機體抗腫瘤免疫功能具有很大的作用。但目前文獻報道的體外實驗大多將蟲草素或CP直接作用于離體細胞，這與臨床實際用藥以及藥物實際作用情況明顯不符。一般在臨床上患者口服用藥后，藥物需經消化道吸收、經血液運送到全身各部、再經機體代謝和排泄，因此對腫瘤起治療作用的成分不一定是藥物的原形，它可以是經代謝后的其他產物，也可以是藥物在體內經過許多中間環節引導機體產生的其他藥理反應，為此我們根據血清藥理學的原則設計了本實驗：先給裸鼠喂飼蟲草素，讓藥物經消化道進入機體，通過一定的代謝過程，使血液富含藥物有效成分，然后提取其血清，在體外將含藥血清和（或）聯合鉑類化療藥物作用于結腸癌SW 1116細胞，借以間接觀察蟲草素對腫瘤細胞增殖、遷移的影響及其誘導細胞凋亡的作用。如此設計似較直接加藥法更符合臨床實際，更為合理。

      “血清藥理學”的概念和基本原理最早在1988年由日本學者田代真一提出，用于改進以前的不太合理的體外藥理實驗方法。事實上體外實驗是藥理的實驗研究中不可或缺的手段。其優點是條件可控性強，可在細胞、亞細胞水平進行超微、生化、受體、基因等方面的研究，揭示藥物機制較為深入，重復性好，使用材料少。但隨著研究的深入，某些藥物直接加入離體反應體系進行體外實驗的研究方法存在很多問題。由于某些藥物化學成分復雜，口服后體內要進行一系列的生物轉化以發揮藥效，而且理化性質復雜，經常造成一些假陰性和假陽性的結果，例如：20世紀50、60年代國內外用腫瘤細胞株在體外過篩數千種植物提取物，報道了上百個陽性結果，但用于體內實驗結果大部分為陰性。這促使各國學者不斷努力，尋找更好的方法。1984年，在日本召開的第一屆和漢醫藥學會上，日本學者首次提出給動物灌服藥物一定時間后，取其血清進行實驗的藥理學新方法。1988年田代真一正式提出了“血清藥理學”這一新概念。此后，血清藥理學廣泛應用于腫瘤、心血管、消化、免疫等方面的藥理學研究中，并與體外實驗所見作比較，取得了很大的進展。為此本研究應用血清藥理學方法，進行蟲草素抗結腸癌的體外實驗。

二、蟲草素對結腸癌細胞抑增殖、抗遷移和促凋亡的作用

      人結腸癌細胞具有增殖快、易于向周圍組織浸潤及經淋巴道早期轉移的特點，這是結腸癌導致患者死亡的重要原因。腫瘤細胞的遷移是造成腫瘤轉移的重要因素。有效地抑制腫瘤細胞增殖、減少細胞遷移，可以減少腫瘤轉移的發生率。本研究通過CCK-8細胞增殖抑制實驗發現，蟲草素組血清在作用于結腸癌細胞株SW1116 24h后出現顯著抑制細胞增殖的作用，但對細胞增殖的抑制作用不如傳統化療藥物順鉑明顯。蟲草素與順鉑聯合使用24～72 h，其對細胞增殖抑制作用與單純使用順鉑時相同，但當96h后，聯合用藥組對細胞增殖的作用明顯強于單純化療組（P＝0.02）。提示早期、足量和長期應用蟲草素能有效地抑制結腸癌細胞的增殖，這與黃浩等的研究一致。蟲草素不能替代順鉑。但蟲草素在長期應用后有明顯的輔助化療的作用。

       Transwell小室法測定細胞遷移的實驗顯示，蟲草素能有效減少腫瘤細胞遷移的發生。蟲草素聯合順鉑后減少遷移發生的作用更為明顯，相比單純應用順鉑組差異有統計學意義（P＜0.05）。說明蟲草素能減少腫瘤細胞遷移的發生，聯合人體正常組織器官中，細胞的凋亡與增殖保持動態平衡，一旦平衡被打破，將導致細胞的惡性轉化和腫瘤的發生。因此，誘導腫瘤細胞發生凋亡，有利于預防腫瘤的發生和轉移。本研究通過Hoechst 33258熒光染色定性研究，在蟲草素組中見到大量凋亡細胞，在聯合用藥組中似乎凋亡細胞數量更多。采用流式細胞儀法定量檢測細胞凋亡率，結果發現聯合用藥組細胞凋亡率顯著高于其他三組（P＜0.05），說明蟲草素聯合化療藥物有較強的誘導腫瘤細胞凋亡的作用。這可能是其抑制腫瘤結節增大的原因之一。

       運用血清藥理學方法進行體外實驗，結果顯示，蟲草素能有效抑制結腸癌細胞株 SW1116的增殖、并有誘導腫瘤細胞凋亡和抗遷移的作用；蟲草素聯合順鉑使以上的抑增殖、抗遷移和促凋亡作用更為明顯。

（摘自：《中華臨床醫師雜志》2011年第5卷第14期：4048-4054）