不同劑量蟲草活力素對大鼠支氣管哮喘模型慢性氣道炎癥的作用機制研究

張 旻¹  周 新¹  唐 亮²  余伯成²  李 群¹  張國清¹

（1. 上海交通大學附屬第一人民醫院呼吸科，上海200080；

2. 上海國寶企業發展中心，上海200001）

【摘要】 目的 對不同劑量蟲草活力素(簡稱蟲草) 在大鼠支氣管哮喘(簡稱哮喘) 模型慢性氣道炎癥中的抑制作用及相關機制進行初步探討。方法 Wister 大鼠，隨機分為對照組、 單純模型組、 蟲草20 mg/ kg、 50 mg/kg 組、布地奈德( BUD) 組及 BUD 聯合蟲草素干預組。卵蛋白致敏建立大鼠哮喘模型后給予藥物干預 8 周，對各組支氣管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 進行細胞分類計數及觀察肺組織的病理變化，同時應用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清和 BALF 的哮喘相關細胞因子水平。結果 與單純模型組比較，蟲草兩種劑量治療組均降低慢性哮喘大鼠 BALF 的細胞總數和嗜酸粒細胞數，差異有統計學意義( P < 0. 05)，并呈劑量相關性；HE 染色顯示大劑量蟲草、BUD治療組及聯合用藥組較單純模型組炎癥細胞浸潤、平滑肌肥厚及黏膜肺組織水腫等炎癥表現明顯減輕；較單純模型組，蟲草治療組血清及 BALF 的白介素 4(IL-4)、 IL-14 水平下降，干擾素γ升高，差異有統計學意義( P < 0. 05)，并呈劑量相關性。結論 一定劑量的蟲草可通過上調T輔助細胞1( Th1)相關細胞因子，下調Th2 相關細胞因子，減少嗜酸粒細胞等炎癥細胞滲出，抑制哮喘的慢性氣道炎癥，并與糖皮質激素具有協同作用。

      支氣管哮喘( 簡稱哮喘) 作為一種常見呼吸系統慢性疾病，可累及不同年齡組的人群, 病程長達數十年。其發病率在世界范圍內持續上升，未來 15~ 20 年內，全球哮喘患者將由目前的3億達到4億，并引發嚴重的疾病相關經濟負擔。近年研究表明哮喘的發病機制可能為某些環境因素作用于遺傳易感個體，通過 T 細胞調控的免疫介質釋放機制(細胞因子、炎癥介質) 作用于氣道產生炎癥及氣道高反應性；同時氣道結構細胞特別是氣道上皮細胞與上皮下基質及免疫細胞的相互作用以及氣道神經調節的異常均加重了氣道高反應性，也直接或間接加重了氣道炎癥。

       蟲草活力素( 簡稱蟲草) 為北冬蟲夏草的主要活性成分，北蟲草是蟲草屬的模式種，與冬蟲夏草為蟲草屬的同屬異種真菌，兩者的化學成分、營養成分和藥用功能均非常相似，其主要藥用成分蟲草素等含量遠高于野生冬蟲夏草，因此被選為冬蟲夏草的最佳替代品而進行大量的人工培育。目前大量藥理學研究表明具有耐缺氧、抗炎、調節免疫功能，抗肝纖維化等作用，有研究表明，蟲草可通過調節支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 中的細胞含量，降低蛋白酶活性而對于由內毒素引起的小鼠急性肺損傷具有保護作用，并可通過對大鼠肺氣腫模型 T 輔助細胞 1( T h1) / T h2 相關細胞因子平衡的糾偏作用改善氣道慢性炎癥，但蟲草在哮喘動物模型氣道炎癥中的作用目前國內外尚缺乏系統性研究的報道。本研究旨在通過觀察慢性炎癥相關性指標的變化，對蟲草在慢性哮喘的氣道炎癥反應中干預作用及靶位進行初步探索，從而對其潛在的抗炎療效提供實驗依據。

       哮喘是由嗜酸粒細胞、肥大細胞、T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、氣道上皮細胞和樹突狀細胞等多種炎癥細胞和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥疾病。目前認為 Th1/ T h2 失衡即 Th2 細胞介導可能是其最初發生的機制之一。Th1細胞因子包括IFN-γ 、IL-2 等, INF-γ可通過激活 IL-17F干擾素誘導蛋白-10 信號通路、T 盒轉錄因子蛋白、一氧化氮途徑以及下調嗜酸粒細胞趨化因子受體等途徑在抑制哮喘炎癥反應中發揮作用。而Th2細胞產生 IL-4、IL-5和 IL-13等細胞因子, 其中IL-4和IL-13能誘導B細胞成熟和分化以及合成和釋放與哮喘病情的嚴重程度、氣道炎癥以及氣道高反應性的持續存在密切相關抗原特異性免疫球蛋白E, Th2細胞通過酪氨酸系統的JAK家族而被磷酸化, 進而啟動特異性基因的表達和轉錄, 包括嗜酸粒細胞趨化蛋白、IL-4 及IL-13 等, 并形成正反饋和炎癥級聯效應, 共同導致氣道炎癥的發生和發展; IL-5能促進嗜酸粒細胞增殖、成熟、活化并募集至氣道黏膜, 成熟的嗜酸粒細胞有密集的細胞內顆粒, 包括主要堿基蛋白和可刺激肥大細胞釋放組胺的嗜酸粒細胞陽離子蛋白等, 因此本研究選擇BALF細胞總數、各型細胞數分類以及 T h1 相關因子 IFN-γ和 T h2 相關因子 IL-4 及 IL-13作為哮喘慢性炎癥的量化觀察指標, 同時結合形態學觀察。

       蟲草活力素的主要藥效成分為蟲草素, 即 3’ -脫氧腺苷, 它對核因子κB活性、絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶和P38 磷酸化的抑制實現抗炎作用已在 Kim 等對脂多糖誘導的炎癥實驗中證實。由于維持Th1/ Th2 平衡安全有效的藥物無疑是目前控制哮喘慢性炎癥的持續和發展的潛在靶點, 因此本研究將此藥作為主要干預藥物, 但鑒于其在哮喘領域尚無相關研究, 故本研究在設立不同劑量治療組的同時, 建立迄今抑制哮喘炎癥的最主要的治療藥物-糖皮質激素治療組以及聯合治療組, 以觀察其量效關系且有無協同作用。

      本研究顯示兩種劑量蟲草治療組較單純模型組均能顯著抑制 BALF中嗜酸粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞的滲出, 其中 50 mg/ kg 劑量組對嗜酸粒細胞的抑制要顯著優于 20 mg/ kg 組, 提示存在量效性。同時, 50 mg/ kg 劑量組雖對各細胞數在數值上高于BUD組, 但差異無統計學意義, 而其顯著低于聯合用藥, 則提示兩藥可能存在協同性。有研究表明腺苷在炎癥反應中的調節作用通過隸屬G-蛋白耦聯受體超家族的腺苷受體(AR)介導, 已知有 A1AR、 A2aAR、A2bAR、A3AR 4種亞型, 在支氣管肺組織中均有分布。抗原吸入可降低哮喘患者痰液和血清中 AR 的表達, 其中 A2aAR 活化可抑制多種炎性細胞的聚集和炎癥介質的釋放, 因此推測蟲草對于炎癥細胞的療效可能與腺苷A2aAR受體相關。

       我們發現不論在血清和 BALF, 對IL-4、IL-13和 IFN-γ水平, 蟲草素均表現出一定的量效性, 但對于全身的炎癥抑制作用優于局部炎癥抑制作用, 且聯合用藥除對血清IL-4的抑制顯著優于BUD治療組, 在其他細胞因子的干預作用無治療優勢。較 BUD, 蟲草素對于上調 Th1 相關細胞因子的干預作用更明顯, 但結合形態學觀察, 預示 Th1 上調對于哮喘慢性炎癥的保護作用有限, 雖然近年研究大部分研究支持 Th1 相關炎癥因子可通過抑制 Th2 作用緩解哮喘的慢性氣道炎癥炎癥, 但哮喘動物模型中引入Th1細胞后加重氣道炎癥的實驗表明其對于肺部病理性免疫有促進作用, 因此對于哮喘慢性炎癥, Th1/ Th2 比值與哮喘慢性炎癥相關性有待進一步研究。

       總之, 本實驗表明達到一定治療劑量的蟲草可通過全身和局部上調 Th1 相關細胞因子, 下調Th2相關細胞因子, 減少嗜酸粒細胞、中性粒細胞滲出抑制哮喘慢性炎癥, Th2 相關細胞因子的下調可能較Th1相關細胞因子的上調在慢性炎癥的抑制作用更明顯。研究結果雖提示蟲草單獨用藥對于炎癥細胞和炎癥因子的抑制作用低于糖皮質激素, 但聯合用藥具有潛在的協同作用。

(摘自: 《國際呼吸雜志》2010年8月第30卷第15期：897-901)