蟲草活力素對大鼠慢性支氣管哮喘模型氣道重塑作用初探

張 旻¹ 周 新¹ 唐 亮² 余伯成² 李 群¹ 張杏怡¹  張國清¹

(1. 上海交通大學附屬第一人民醫院呼吸科，上海200080；

2. 上海國寶企業發展中心，上海200001)

【摘要】 目的 對蟲草活力素(簡稱蟲草) 在大鼠支氣管哮喘(簡稱哮喘) 模型氣道重塑中的作用及相關機制進行初步探討。 方法 50只Wister大鼠[6~8周齡， (200±20) g]，隨機數字表法分為陰性對照組(A)、慢性哮喘單純模型組(B)(卵清白蛋白系統致敏和反復激發) 、慢性哮喘+蟲草50 mg/kg 治療8周組(C)、慢性哮喘+ 布地奈德(BUD) 8 周治療組(D)及慢性哮喘+BUD聯合蟲草8周治療組(E)。肺組織切片HE染色觀察病理變化并檢測氣道管壁厚度，采用免疫組織化學法檢測氣道轉化生長因β₁(TGF-β₁)表達水平，應用逆轉錄PCR 法檢測肺組織A2a腺苷受體(A2aAR)mRNA 表達。數據統計采用ANOVA檢驗進行組間分析, Mann-Whitney 檢驗進行組內兩兩比較, Spearman 等級相關分析。 結果 ①HE染色顯示所有藥物干預組較單純模型組炎癥細胞浸潤、平滑肌肥厚及黏膜肺組織水腫等炎癥表現明顯減輕，以D和E組最為明顯；②5組氣道管壁厚度依次分別為( 9.89±2.09) 、( 21.72±3.16) 、( 14. 94±1.96) 、 ( 12.29±2.75)和( 12.25±2.32) μm²/μm， F = 31.37， P <0.0001，所有藥物干預組氣道壁厚度均高于對照組(C組、D組和E組與A組比較后的P值分別為0.0001、0.0524、0.0524) ， 且低于單純模型組(C組、D組和E組與B組比較后的P值均< 0.0001)，差異有統計學意義， C 組氣道壁較D組和E組增厚， 差異有統計學意義(P值分別為0.0232和0.0147)；③5組TGF-β₁表達強陽性率分別為(2.08±1. 63) %、(29.37±5. 08) %、( 12.30±3.26) %、(10.78±3. 35) %及( 7.43±2. 84) %，F =86. 45，P < 0.0001，所有藥物干預組 TGF-β₁蛋白表達均高于對照組(C組、D組和E組與A 組比較后的P值均<0.0001)，且低于單純模型組(C組、D組和E組與B組比較后的P值均< 0.0001)，差異有統計學意義；E組較C組的蛋白表達有統計學意義下降( P = 0.005 2) ； ④5組肺組織 A2aAR mRNA 表達相對強度依次為( 0.35±0.06) 、( 0.27±0. 10)、( 0.52±0. 07) 、( 0.24±0.05) 及( 0.47±0.08) ， F =26.46， P< 0.0001，C組和E組A2aAR mRNA 表達高于A組( P值分別為0.0001及0.0007)、B組( P值分別為0.0002及0.0003) 和D組(P值均< 0.0001)，差異有統計學意義，D組表達低于A組，差異有統計學意義( P = 0.0003)；⑤所有大鼠支氣管壁厚度與氣道 TGF-β₁蛋白表達存在正相關( r = 0.80，P <0.01)，而C組大鼠肺組織 A2aAR mRNA 表達和 TGF-β₁蛋白表達呈負相關( r =－0.68，P = 0.03)。結論 蟲草對哮喘模型的氣道重塑具有一定的改善作用，其機制可能通過增加慢性哮喘模型大鼠肺組織 A2aAR mRNA 轉錄，抑制氣道 TGF-β₁的生成，從而減輕氣道重塑，且蟲草與糖皮質激素聯合應用對于降低 TGF-β₁的表達具有潛在協同作用。

      支氣管哮喘(簡稱哮喘)作為一種常見呼吸系統慢性疾病, 其發病率在世界范圍內持續上升。哮喘主要表現為氣道高反應與變異性較大的可逆性氣流阻塞, 目前認為上述改變的主要成因在于氣道的持續性損傷和結構異常, 即謂氣道重塑, 而轉化生長因子β₁(TGF-β₁) 是迄今發現在氣道重塑最強的促氣道纖維化因子。

      蟲草活力素(簡稱蟲草) 為北冬蟲夏草的主要活性成分, 目前大量藥理學研究表明其具有耐缺氧、 抗炎、調節免疫功能及抗肝纖維化等作用, 其作用靶點可能在于腺苷受體( AR)。本研究旨在通過觀察大鼠氣道中TGF-β₁的表達以及氣道中 ARmRNA 的轉錄變化, 對蟲草在慢性哮喘氣道重塑中的干預作用及靶位進行初步探索。

      哮喘的氣道重塑是由多種細胞、炎癥介質、生長因子參與下出現的不完全修復, 由于尚無重塑過程完全依賴于慢性炎癥的令人信服的證據, 因此有學者認為氣道重塑可能與氣道炎癥并行, 并導致慢性炎癥的發生和持續。氣道重塑主要表現為氣道壁增厚、細胞外基質(ECM) 沉積、氣道血管生成/ 血管重塑、氣道平滑肌增生、肥大及黏液腺增生和黏液性化生。雖然哮喘重塑與間質性肺疾病所致肺纖維化的典型病理特征相似, 但由于哮喘氣道慢性炎癥主要為嗜酸粒細胞(EOS) 浸潤, 巨噬細胞與其他細胞增加很少或不增加, 因此又有其特殊性。其調控因素眾多, 包括生長因子、T輔助細胞(Th) 1/ Th2 細胞因子失衡、 基質金屬蛋白酶、 內皮素、 前炎癥細胞因子以及趨化因子等。

       眾多研究顯示在生長因子中, TGF-β₁可能是哮喘氣道重塑的主要調控因子, 而其亞型 T GF-β₁是成纖維細胞的化學誘導劑, 通過自分泌、 血小板衍生生長因子途徑對成纖維細胞的增殖發揮雙峰效應, 同時也是成纖維細胞膠原最有效的刺激劑。因此本研究以 TGF-β₁作為觀測指標, 結果顯示其表達水平與氣道管壁厚度呈正相關, 再次印證了上述觀點。由于當前吸入性糖皮質激素仍是預防氣道重塑的首選治療, 故本研究以BUD作為陽性對照藥物, 同時增加聯合治療組, 以觀察其是否存在協同作用。結果發現單獨使用蟲草治療較單純哮喘模型支氣管壁厚度顯著下降, 但仍差于糖皮質激素治療組, 而糖皮質激素單獨用藥和聯合蟲草對于支氣管壁厚度改善無差異, 提示蟲草雖可在一定程度改善氣道重塑, 但是較糖皮質激素而言仍有差異。而對于TGF-β₁在肺組織的表達結果則顯示蟲草和糖皮質激素無治療差異, 且聯合用藥具有顯著的協同作用, 提示蟲草對于 TGF-β₁ 具有良好的抑制作用, 而糖皮質激素可能同時存在 TGF-β₁以外的作用途徑改善氣道重塑。

       有研究表明, 蟲草可通過調節肺灌洗液中的細胞含量, 降低蛋白酶活性而對于由內毒素引起的小鼠急性肺損傷具有保護作用, 并可通過對大鼠肺氣腫模型 Th1/ Th2 相關細胞因子平衡的糾偏作用改善氣道慢性炎癥, 但蟲草在哮喘動物模型氣道重塑中的作用目前國內外尚缺乏系統性研究的報道。

       蟲草的主要藥效成分為蟲草素, 即 3’-脫氧腺苷, Linden研究發現胞外腺苷聚集是炎癥反應初始階段限制細胞損傷的機體防御性反應, 是保護性的自分泌和旁分泌的信號轉導機制。腺苷和其他內源性物質在炎癥反應中適度激活抑制性信號傳導系統, 其重要性在多種炎癥疾病中都已被證明( 如敗血癥、類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化和腫瘤等)。腺苷在炎癥反應中的調節作用是通過 AR 介導, AR 屬 G-蛋白耦聯受體超家族, 目前已發現4種亞型, 分別是 A1AR、 A2aAR、A2bAR 和A3AR[11], 其在支氣管肺組織中均有分布, 研究表明抗原吸入可降低哮喘患者痰液和血清中AR的表達。而其中A2aAR 活化可抑制多種炎性細胞的聚集和炎癥介質的釋放已在多項研究中證實^, 故本研究以 A2aAR 作為蟲草的推測作用靶點進行研究, 結果發現哮喘模型組 A2aAR mRNA 的含量較正常對照組降低亦證實了上述觀點。本研究顯示蟲草可增加 A2aAR mRNA 轉錄水平, 且在蟲草組 TGF-β₁和 A2aAR mRNA 含量呈負相關, 提示蟲草可能通過A2aAR 的表達增加抑制TGF-β₁的生成, 從而減輕氣道重塑。而A2aAR 和TGF-β₁的表達在其他各組無相關性存在, 是否預示低于或等于生理狀態的 A2aAR 表達水平未參與TGF-β₁表達有待于進一步研究。而且值得注意的是, 糖皮質激素組 A2aAR 表達與哮喘模型組無差異, 且反較正常組降低, 提示糖皮質激素對于哮喘氣道重塑可能未經過A2aAR 途徑。結合對于氣管壁厚度的作用在糖皮質激素和聯合治療無異, 預示A2aAR 途徑在哮喘的氣道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 這也可能可解釋為什么聯合治療對TGF-β₁表達具有協同作用。同時上述結果對糖皮質激素依賴型哮喘的治療探索亦具有潛在的提示意義。

       總之, 本實驗表明蟲草可能通過增加慢性哮喘肺組織 A2aAR mRNA 轉錄, 抑制氣道T GF-β1的生成,從而減輕氣道重塑。由于 A2aAR 的升高在哮喘氣道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 因此蟲草單獨使用對于氣道重塑的改善作用較糖皮質激素有限, 但是聯合用藥對于對于降低 TGF-β1的表達具有潛在的協同作用。

（摘自：《國際呼吸雜志》2011年第31卷第9期：78-83）