北冬蟲夏草水提物對人肺腺癌細胞A549的作用

顏晶晶¹，唐永范²，陸巍杰²，張鑫²，孫加源¹，韓寶惠¹

（1.上海交通大學附屬胸科醫(yī)院肺內(nèi)科，上海200030；

2.上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，上海200001)

 【摘要】目的 探討北冬蟲夏草水提物(CME)對人肺腺癌細胞A549的作用。方法 以不同質量濃度的CME 處理A549 細胞24、48、72 h，CCK8 法檢測細胞生長抑制率。以0.5 mg /mL CME 處理A549細胞(干預組) 12、24和48 h，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率，Western blotting檢測A549細胞增殖相關蛋白(p-ERK 和p-Akt)和凋亡相關蛋白(caspase-3)的表達，以未予CME處理的A549細胞作為對照組。結果 A549細胞生長抑制率隨CME質量濃度的升高和處理時間的延長而上升，呈明顯的濃度－時間依賴性(P＜0.01) 。與對照組比較，干預組G₂ /M 期細胞比例明顯增加( P＜0.01)；干預組細胞凋亡率顯著高于對照組(P＜0.01)，且與CME 處理時間呈顯著正相關( r=0.995，P＜0.01)；干預組p-ERK和p-Akt表達明顯低于對照組，且與CME 處理時間呈顯著負相關( r =－0.881，P＜0.01；r =－0.932，P＜0.01)；干預組 caspase-3 表達顯著高于對照組( P＜0.05)，且與CME 處理時間呈顯著正相關( r=0.681，P＜0.01)。結論 CME 對A549 細胞生長的抑制作用可能與其使細胞阻滯于G₂ /M 期并誘導細胞凋亡有關；CME 有望成為肺腺癌輔助治療藥物。

       肺癌是威脅人類健康的主要疾病，已成為世界范圍內(nèi)引起腫瘤患者死亡的重要原因，占新發(fā)腫瘤病例的14.5%，居各類腫瘤死亡病例的首位，男性占29%，女性占26%。根據(jù)肺癌的不同分期，手術、放療及全身化療是治療肺癌的主要手段，而中草藥輔助治療手段因其不良反應少、依從性好而在肺癌治療領域占主要地位，其中冬蟲夏草是一種珍貴中藥材，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明其具有調節(jié)免疫、降血糖、抗氧化及抗腫瘤等功效。近年來，因國內(nèi)外需求增加，冬蟲夏草供不應求，價格猛漲，急需開辟新藥源。“北冬蟲夏草”( Cordyceps militaris) 也稱蛹草、蛹蟲草或北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬，所含各種化學成分和冬蟲夏草含量基本一致，同樣具有重要的藥用價值。本研究經(jīng)體外實驗觀察北冬蟲夏草水提物( Cordyceps militaris extract，CME) 在抑制人肺腺癌細胞A549生長及誘導其凋亡方面的作用，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

       CME經(jīng)高壓液相色譜儀鑒定含有蛋白質、蟲草素、蟲草多糖、腺苷及多種微量元素，其中的有效成分蟲草素( cordycepin) 為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，結構明確，具有調節(jié)免疫、抗病毒、抗細菌、抗真菌和抗腫瘤的作用。CME因其具有明顯的抑制白血病細胞生長及促凋亡作用，已用于各種白血病的治療，本研究以期通過體外實驗進一步證實CME 對肺癌細胞株A549 的生長抑制及誘導凋亡作用。

       本實驗中，CME處理A549 細胞后倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞有明顯變形、皺縮及死亡現(xiàn)象。細胞活力檢測實驗中，CME分別處理A549細胞24、48和72 h 后，細胞的生長增殖受到明顯抑制，呈濃度－時間依賴性，但在相同質量濃度CME 處理48 h 與72 h的細胞生長抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義，這也是在之后的凋亡率檢測中采用不同時點( 12、24 和48 h) 觀察的原因。實驗觀察到0.5 mg /mL CME 作用細胞24 h，與其他各質量濃度組的細胞生長抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義，且細胞生長抑制率＜50%，因此選取0.5 mg /mL 質量濃度作為細胞周期和凋亡試驗的作用濃度。本實驗結果顯示：CME可以阻滯A549 細胞于G₂ /M 期，從而抑制了細胞的進一步分裂增殖；同時，CME作用下的細胞凋亡率隨著作用的時間延長而呈升高趨勢，且明顯高于對照組，說明CME 具有誘導A549 細胞凋亡的作用，但本研究不足的是未經(jīng)免疫熒光實驗證實CME 處理后凋亡細胞的特征。

       細胞的分裂增殖信號通路通過調控多種增殖相關信號蛋白發(fā)揮作用。在細胞內(nèi)的增殖信號轉導途徑中最重要的就是絲裂原活化蛋白激酶( mitogenactivated protein kinase，MAPK) 通路和磷酸肌醇－3激酶/蛋白激酶B ( phosphoinositide 3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt) 通路。ERK 是MAPK 的重要成員，而Akt 是PI3K 經(jīng)多種生長因子活化后的下游靶點，兩者與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及轉移等密切相關。已經(jīng)證實PI3K/Akt 途徑的相關基因整體表達水平與非小細胞肺癌之間具有明顯的相關性。ERK 和Akt 均經(jīng)磷酸化后激活了數(shù)量眾多的蛋白，包括轉錄因子、細胞骨架蛋白、激酶及其他酶，進而發(fā)揮調節(jié)細胞的分裂增殖及調控細胞周期的作用。本實驗中，經(jīng)CME 處理的肺腺癌細胞A549 中p-ERK及p-Akt蛋白均呈低表達，說明CME 的抑制作用干擾了MAPK 和PI3K/Akt 通路中的ERK 及Akt 磷酸化水平，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞生長的抑制作用，并且阻滯細胞周期于G₂ /M 期，這與之前報道的蟲草素抑制人宮頸癌細胞株Hela 及人口腔上皮鱗狀細胞OEC-M1及結腸癌細胞HCT116 周期于G₂/M 期的結論一致。

      在細胞凋亡過程中半胱氨酸蛋白酶家族( caspase)引發(fā)的級聯(lián)反應是中心環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導的信號轉導途徑，激活下游的效應caspase，其中caspase-3 在凋亡過程中起著關鍵作用，然后通過切割特異性底物，導致細胞凋亡。有研究結果顯示：CME 通過提高caspase-3的活性起到促白血細胞HL-60 凋亡作用。本實驗觀察到，經(jīng)CME 作用的A549 細胞caspase-3 相對表達增加，活力明顯增強，說明其具有明顯誘導細胞凋亡的作用。有研究結果顯示：P-Akt 表達下降也可通過激活下游凋亡因子，使caspase-3 表達增加。CME 通過caspases 作用及改變線粒體膜的通透性來促進乳腺癌細胞MDA-MB-231 凋亡。水提物引起的凋亡與Akt 失活有關，并且符合時間依賴性，此誘導凋亡作用可被LY294002-PI3K/Akt 的抑制劑所消除，說明水提物誘導的凋亡與caspase-3 活性增強和Akt 失活有關。因此，我們認為CME 通過抑制ERK及Akt 磷酸化水平，在北冬蟲夏草促細胞凋亡過程中可能發(fā)揮一定的作用，本研究并未采取2條信號通路的阻斷劑阻斷信號通路后觀察分析凋亡是否受到影響，因此CME 經(jīng)何種凋亡途徑實現(xiàn)這種作用尚有很大的研究空間。

       由此可見，CME 具有抑制肺腺癌細胞增殖及誘導細胞凋亡作用，為臨床應用北冬蟲夏草制劑作為抗肺癌治療的輔助手段提供了有利的證據(jù)，但有關CME的抗肺癌機制仍需進一步的體內(nèi)試驗加以證實。

（摘自：《上海交通大學學報》（醫(yī)學版）2011年第31卷第7期：922-926）